cara Identifikasi Virus Influenza ( A dan B ) metode RT-PCR

Identifikasi Virus Influenza ( A dan B ) metode RT-PCR

a) Pengertian

Virus lnfluenza adalah penyakit infeksi saluran pernafasan yang disebabkan oleh virus influenza yang mudah menular. Penularan virus dapat terjadi melalui udara pada saat orang berbicara, batuk dan bersin.

b) Metode

RT-PCR

c) Tujuan

Untuk mengetahaui titer tertinggi yang masih bisa menyebabkan hemaglutinasi secara total.

d) Prinsip kerja

Gen dari virus influenza adalah RNA maka RNA tersebut harus di tambahkan atau diubah terlebih dahulu menjadi complementary DNA ( c DNA ), dengan proses RT, setelah itu, baru dilanjutkan dengan tahapan perbanyak DNA melalui proses PCR, keseluruhan tahapan tersebut disebut RT-PCR. Proses RT-PCR memerlikan sepasang oligonukleotida atau primer DNTPS, template RNA, dengan enzim tag DNA polymenase.

e ) Prosedur kerja

l. Pra Analitik

   a. Alat

       1) Mikropipet

       2) Tips putih

       3) Well plate

       4) Cup sampel

       5) Centrifuge

       6) Pcr

       7) Plastik tahan panas

       8) Komputer

b. Bahan

    1) Sampel suap tenggorok

    2) Reagen 2x PCR master mix

    3) Nuclecse Free Water

    4) Enzim tag

    5) Primer F ( Flu A dan B)

    6) Reagen AWI

    7) Reagen probe, Buffer avi, Buffer carier RNA

    8) Alkohol absolut

    9) Spin colum

  10) Reagen AW2, Reagen pelant RNA

ll. Analitik

Cara kerja

1) Di siapkan alat dan bahan yang akan di gunakan

2) Pertama-tama di buat ekstrasi sampel dengan cara :

a. Pipet buffer AVL sebanyak 2,24 ml kedalam cup sampel lalu tambahkan buffer carier RNA sebanyak 22,4 µl

b. Kemudian tambahkan 560 µl sampel lalu tambahkan kembali alkohol absolut sebanyak 560 µl.

c. Kemudian masukan spin colum kedalam cup sampel yang kosong lalu tambahkan kedalamnya campur di atas.

d. Centrifuge dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit pada suhu 2-8 °c.

e. Apabila sampel masih tersisa maka ulangi ekstrasi sampai selsai.

f. Buang cairan atau larutan dengan cup sampel lalu pindah kan spin columnya ke cup sampel yang kosong, kemudian tambahkan buffer AWI sebanyak 500 µl, kemudian centrifuge selama 1 menit dengan kecepatan 8000 rpm.

g. Setelah itu buang lagi cairan yang tidak akan digunakan lalu pindahkan spin columnya ke cup sampel yang baru lalu tambahkan buffer AW2 sebanyak 500 µl.

h. Centrifuge dengan kecepatan 14000 rpm selama 3 menit, setelah selsai di centrifuge kembali selama 1 menit.

i. Lalu tambahkan 60 µl pelarut RNA dan masukan kembali spin columnya, centrifuge dengan kecepatan 8000 rpm selama 1 menit.

j. Setelah selsai, buang spin colum dan tersisa sampel yang telah diekstrasi yang berisi RNA dari virus.

3. Setelah diekstrasi sampel maka yang selanjutnya di buat reagen mix, dengan cara :

a. Pipet reagen 2x PCR master mix kedalam cup sampel sebanyak 100 µl ( 2 cup)

b. Tambahkan masing-masing reagen Nuvlease Free Water sebanyak 44 µl, kemudian tambahkan lagi reagen enzim tag sebanyak 4 µl.

c. Setelah itu, untuk reagen mix A di tambahkan reagen primer F, primer R, dan reagen probe khusus influenza A masing –masing 13 µl, begitupun untuk reagen mix B.

4. Kemudian masukan kedalam wall plate di pipet reagen mix yang telah ditentukan, masing-masing 20 µl.

5. Untuk kontrol Negatif dipipet reagen RNA free water sebanyak 5 µl , masing-masing untuk lnfluenza A dan B.

6. Kemudian tambahkan sampel yang telah di ekstrasi ke dalam wall plate khusus sampel sebanyak 5 µl, masing-masing untuk lnfluenza A dan B.

7. Untuk mock hanya berisi reagen mix saja, sedangkan untuk kontrol Positif ditambahkan masing-masing 5 µl reagen khusus kontrol Positif Adan B.

8. Kemudian well plate di tutup dengan plastik tahan panas lalu masukan ke dalam alat.

9. selanjutnya sampel di kontrol pada komputer terlebih dahulu mengatur programnya dengan cara :

a. Program 1 : reverse transkriptase → 1 siklus pada suhu 50 °c selama 30 menit.

b. Program 2 : ingkubasi di inhibitor tag → 1 siklus pada suhu 95°c selama 2 menit.

c. Amplifikasi → program 3 → 45 siklus pada suhu 1 : 95°c selama 15 detik → denaturasi pada suhu 2 : 55°c selama 30 detik →Anneling Elongasi.

10. Apabila hasil positip lnfluenza A dan B maka dilanjutkan pemeriksaan selanjutnya yaitu penentuan H1 atau H3 ,dengan cara :

a. Pipet reagen mix H1 dan H3 sebanyak 20 µl termaksuk kontrol negatif , mock, control positif dan juga untuk semua sampel yang akan di priksa.

b. Untuk kontrol negatip di butuhkan reagen RNA free wates sebanyak 5 µl.

c. kemudian tambahkan sampel pada well plate yang telah di tentukan sebanyak 5 µl.

d. Untuk mock hanya berisi reagen mix saja, sedangkan untuk kontrol positif H1 dan H3 masing-masing dipipet sebanyak 50 µl.

III. Pasca Analitik

Interpretasi Hasil

1. Positif (+) :berwarna merah

2. Negatif ( -) : berwarna hijau

3. Hasil di anggap valid apa bila :

    a. Control negatif → tidak terjadi amplifikasi → hijau

    b. Mock → tidak terjadi amplifikasi → hijau

    c. Control positif (+) harus amplifikasi → merah

    d. Kurva akan selalu sigmoid.